基因疗法——或许能为阿尔兹海默症（AD）治疗带来福音！

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撰文：EffieLiu、HXQHXQ

审稿：insoulter

编辑：茄子

【前言】阿尔兹海默症（AD）一直是亟待攻克的疾病之一，但目前的药物治疗收效甚微。而近来来自伦敦皇家学院的科研团队通过将PGC-1α基因导入AD模型鼠的大脑内，并阻止了AD的发展，为AD的治疗提供了潜在有效的新手段——基因疗法。

阿尔兹海默症（Alzheimer’sdisease, AD）是一种进行性神经退行性疾病，是老年痴呆中最常见的一种类型。患者遍布全球各地，该病不仅对病患带来死亡的威胁，也给患者家属带来沉重的心理和经济负担。而目前针对AD的药物治疗也只是治标不治本。

大量研究表明，AD的主要病理特征是大脑中β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积和Tau蛋白过度磷酸化造成神经原纤维缠结。Aβ聚集成的二聚体可以削弱突触的结构和功能，是最小的突触毒性物质，它还可以进一步缠结成纤维，进而引发神经元凋亡。目前大量的治疗手段都着眼于减少Aβ的产生，但是近年来各大公司以Aβ为直接靶点的药物研发均以失败告终，科学家们开始反思：当我们看到Aβ沉积时已经意味着疾病到达晚期，神经元的损伤已经无法恢复，我们应该往回找，追溯Aβ产生的原因，尽力将疾病“扼杀在摇篮中”。

图1 神经元附近聚集的β-淀粉样蛋白（黄色）

来自伦敦皇家学院的科研团队提出了一项非常有潜力的新型基因疗法，用于治疗AD。

基因疗法，也叫基因治疗（gene therapy）是指利用分子生物学手段，将核酸导入患者体内，使其表达基因产物（如蛋白质），或对患者基因进行编辑，从而达到治疗疾病的目的。我们目前熟知的治疗方法大多是通过药物来达到治疗疾病的目的（即药物治疗），而基因治疗，可以理解为直接将基因作为药物，通过一些方法使基因这种“药物”进入患者体内，并在细胞中发挥其“药效”（表达蛋白质等产物，或修饰人体内的缺陷基因），从而治愈疾病。

图2 基因疗法

伦敦皇家学院的科研团队将他们此前的研究成果——在细胞水平上，PGC-1α能阻止Aβ的形成，运用基因治疗手段，将该实验进一步推广至小鼠模型，他们首先将PGC-1α基因连接到一种慢病毒载体上，注射入小鼠脑内，使PGC-1α在特定脑区表达。然后，对处理后的小鼠进行了行为学实验和分子水平上的实验，最终证明了在小鼠中，利用病毒载体表达PGC-1α，同样可以阻止Aβ的形成。该项研究的意义在于证明了运用基因疗法治疗AD是可行的，这为AD的治疗提供了一种新的思路。

2011年该团队发表文章称在细胞水平上PGC-1α能够阻止Aβ的形成。PGC-1α是过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）辅助激活因子1α，其通过同时激活PPAR-γ和其他转录因子来控制主要的代谢功能。PGC-1α在高耗能组织中大量表达，如脂肪组织、肝脏、骨骼肌、心脏、肾脏以及脑，并参与糖脂代谢、氧化磷酸化以及线粒体发生的调节。而此项研究中，该科研团队主要对PGC-1α在神经退行性疾病中的影响进行了研究，对AD病人和正常人的脑皮质细胞核提取物进行Western Blotting（蛋白印记分析）实验，结果显示AD病人的PGC-1α含量明显低于正常人。并且细胞实验（WesternBlotting）显示，PGC-1α过表达会引起Aβ减少（图3）。

图3.PGC-1α过表达引起Aβ减少

为了确定PGC-1α在动物水平是否也具有这般潜在的治疗效果，该团队运用病毒载体将PGC-1α运送到AD模型小鼠的特定脑区，最终发现这种PGC-1α选择性递送的方法对治疗AD有非常大的价值。该研究在《美国科学院院报》（PNAS）上发表。

他们首先希望构建一种能在小鼠脑内神经元中表达人类PGC-1α（human PGC-1α, hPGC-1α）基因的载体。

他们将狂犬病病毒糖蛋白B2c(rabiesvirus glycoprotein B2c, RVG)与慢病毒（Lentiviral Vector, LV）DNA构建在一起。慢病毒载体是以人体免疫缺陷病毒（HIV）为基础发展来的基因治疗载体，能够转染神经元，并且可将其基因组整合于宿主基因组上，能够长时间、稳定地表达外源基因。狂犬病病毒表面糖蛋白有很强的嗜神经性，可以高效地与神经末梢结合，并能通过神经轴浆运输侵入神经系统。他们的实验证明，改造后的假性包装病毒载体有很好的亲神经性，而且能沿着神经元轴突逆向运输，将目标药物运至胞体。

分别将目的基因eGFP（增强型绿色荧光蛋白基因）和hPGC-1α连接至改造的LV慢病毒上，构建了两个质粒载体, LV-eGFP（对照组）和LV-hPGC-1α（实验组）（图4）。实验结果显示所构建的载体在大脑皮质（cortex）和海马区（HIP）的锥体神经元表达效率更高，这也正是实验所需。因为大脑皮质负责长时记忆、推理、思考和情绪，皮质受损会引起抑郁、算术、行为上的障碍；而海马区负责短时记忆、定位等功能，海马受损会导致记忆缺失，如忘记今早上吃过什么，怎么回家等。从而可以进一步考察AD有关的病理特征。

图4.质粒载体基因构建图。上：LV-eGFP（对照组）

                                                 下：LV-hPGC-1α（实验组）

（V5tag：通过V5tag的抗体来检测LV-hPGC-1α蛋白的表达）

然后他们对实验组与对照组小鼠分别进行了一系列与记忆相关的行为学实验。

hPGC-1α的表达改善APP23小鼠的空间记忆和认知记忆

将LV-eGFP和LV-hPGC-1α分别注射到正常野生型小鼠（wild type,wt）和APP23小鼠（阿尔兹海默症模型）中，实验条件就有四种小鼠：wt/LV-eGFP，wt/LV-hPGC-1α，APP23/LV-eGFP，APP23/LV-hPGC-1α，然后在不同时间点对小鼠进行旷场实验，目标定位任务（OLT）和新奇物识别实验（NOR），最后收取小鼠组织（图5）。

图5.实验时间流程

目标定位任务OLT（图6）

目标定位任务是首先将小鼠放入一个含有如图6所示的两个完全相同物体的敞口箱子中3min（Nondisplaced），将小鼠放回笼中，间隔15min，再将小鼠放入物体被移动后的敞口箱子（Displaced）内3min，并分别记录两个“3min”内小鼠“探索”两个物体的时间。（注：“探索”是指小鼠用鼻子触碰物体或者鼻子与物体之间的距离小于2cm的情况）正常情况下，正常小鼠探索新事物（被移动物体）的时间会更长。

实验结果显示APP23/LV-eGFP小鼠表现出空间记忆缺失，因为其无法区分实验中被移动和未被移动的物体，即该组小鼠探索两个物体时间相当。而APP23/LV-hPGC-1α小鼠的空间记忆表现和正常小鼠一致，探索被移动物体的时间更长。（图7）

图6.OLT实验模式图

图7.OLT实验结果

新奇事物识别实验（NOR）

新奇事物实验步骤与目标定位任务基本一致，区别在于第二个“3min”敞开箱子中的其中一个物体被换成新物体（图8）。若小鼠记忆功能正常，那么其探索新事物的时间应该多于其熟悉的事物。实验结果显示APP23/LV-hPGC-1α小鼠能够区分新旧事物，并且探索新事物的时间比熟悉的事物长，而APP23/LV-eGFP小鼠则表现出严重的记忆缺陷（图9）。

图8.NOR实验模式图

图9.NOR实验结果

值得注意的是，hPGC-1α在正常小鼠中表达并不会提高正常小鼠的记忆。这些结果表明慢病毒介导的hPGC-1α表达可以阻止APP23小鼠的记忆缺陷。

那么实验组与对照组小鼠在行为学实验中的表现差异是否有相应的分子基础呢？他们又进行了一系列分子水平上的实验进行了验证。

hPGC-1α减少淀粉样蛋白沉积

APP32/LV-hPGC-1α小鼠在皮质和海马区的Aβ以及沉积斑块的含量显著低于APP32/LV-eGFP小鼠（图10）。他们还发现，在APP32/LV-hPGC-1α小鼠中，Aβ形成的一种关键酶——β-APP裂解酶（β-APP cleaving enzyme, BACE1）的功能受到抑制，而与Aβ的降解有关的基因表达没有显著变化，这就说明，hPGC-1α之所以能够减少Aβ的沉积，很可能不是加速其降解，而是通过抑制其产生作用。

图10. APP32/LV-hPGC-1α和APP32/LV-eGFP小鼠皮质和海马区淀粉样蛋白含量

hPGC-1α减少APP32小鼠的神经炎症

研究表明，与野生型小鼠相比，APP23小鼠中存在更多的神经炎症因子。神经炎症因子可引起小胶质细胞激活，使其具有吞噬性，破坏细胞结构。并且炎症因子如细胞因子、趋化因子及相关免疫蛋白具有促进淀粉样变性、神经变性及影响认知功能的作用。而hPGC-1α能够显著降低APP32小鼠的主要促炎症细胞因子TNF-α和IL-1β的含量，从而减少胶质细胞的激活（图11）。

图11 小鼠皮层免疫荧光染色结果。AmyloGlo标记Aβ，Iba1标记小胶质细胞，GFAP标记星形胶质细胞。

hPGC-1α减少APP32小鼠海马区神经元丢失

12个月后APP32小鼠海马的特定区域会出现神经元丢失。与wt/LV-eGFP小鼠相比，APP32/LV-eGFP小鼠CA3区神经元数量减少30%。APP32/LV-hPGC-1α小鼠神经元丢失情况较轻（图12）。

图12. CA3区神经元定量分析

综上，目前的研究表明将hPGC-1α递送到APP32小鼠中可以减少淀粉蛋白沉积，提高记忆并且阻止神经元丢失。其意义在于描述了一项十分具有潜力的AD治疗措施——基因疗法——能够保护神经元和提高记忆。但有意思的是wt/LV-hPGC-1α小鼠和wt/LV-eGFP小鼠在记忆实验以及神经元数量上并无差异，即hPGC-1α对正常小鼠无影响，并且数据显示hPGC-1α对记忆和神经衰退的保护作用是Aβ生成和相关炎症反应减少的结果。因此PGC-1α需要在促炎症发生状态下才能发挥治疗效果，如同实验中APP32小鼠所表现的hAPP过表达和Aβ生成的状态使得hPGC-1α产生了治疗效果。如此看来，PGC-1α能阻止早期AD的发展，我们也可以在早期检测到AD病人脑中的Aβ时对其使用该疗法。

虽然该研究目前尚在实验室阶段，距离阿尔兹海默病的临床治疗还很远，但鉴于目前我们对于AD几乎“束手无策”的情况，该研究无疑提供了一种新的治疗思路和方向。未来将基因疗法真正运用到AD的治疗之中，则还需要考虑其安全性、有效性等更多的问题。总之，还是很期待该基因疗法真正造福于AD患者。

参考文献

Loukia Katsouri, Yau M. Lim,Katrin Blondrath, Ioanna Eleftheriadou, Laura Lombardero, Amy M. Birch, NazaninMirzaei, Elaine E. Irvine, Nicholas D. Mazarakis, and Magdalena Sastre. PPARγ-coactivator-1αgene transfer reduces neuronal loss and amyloid-β generation by reducingβ-secretase in an Alzheimer’s disease model. PNAS 2016 113 (43) 12292-12297;published ahead of print October 10, 2016, doi:10.1073/pnas.1606171113

Katsouri,L., Parr, C., Bogdanovic, N., Willem, M., and Sastre, M. (2011). PPAR gammaco-activator-1alpha (PGC-1alpha) reduces amyloid-beta generation through aPPARgamma-dependent mechanism. J Alzheimers Dis 25, 151-162.

Rabies virus glycoproteinpseudotyping of lentiviral vectors enables retrograde axonal transport andaccess to the nervous system after peripheral delivery. 

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